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DepleteX法による不要配列除去と低発現遺伝子の検出

DepleteX技術の特異性を活用したNGSライブラリの改善

テクノロジー概要
ゲノムやトランスクリプトームから何百万ものシーケンス解析が可能となり、遺伝子や遺伝的変異に関する新たな発見がもたらされました。しかし残念ながら、これらのリードには、繰り返しキャプチャされる不要なシーケンスが多く含まれています。
今後の更なる発見を加速するためには、これらの多量なノイズとなるシーケンスを削除することが重要で、そのことで豊富な遺伝子シーケンス以外のバックグラウンドとなるノイズを下げることで必要なシーケンスの感度を高めることになります。DepleteXはそれを実行します。
DepleteX テクノロジーは、CRISPR-Cas9 の特異性を利用して、次世代シーケンシング (NGS) ライブラリ内の多量の不要なシーケンスを分解します。従って、DepleteX を使用することで、より低発現のトランスクリプトを検出でき、より深いカバレッジとシグナルの改善が実現できます。

~ 66% ~ 90% > 90%

ヒトゲノムの約66%は反復DNAです　　シングルセルデータセットのリードの内 RNA seq データからのリードの90%>は

約90%はノイズです多くのリボソーム、ミトコンドリア、または

ハウスキーピング遺伝子です

不要な配列を除去し、必要な配列を明確に
ゲノムやトランスクリプトームから何百万ものリードをシーケンスする機能により、遺伝子と遺伝的変異に関する前例のない発見がもたらされました。しかし、残念ながらこれらのリードの多くは、繰り返しキャプチャされる多量なシーケンスで浪費されています。

今後の新たな発見は、このノイズとなる多量なシーケンスをカットすることによって加速される可能性があります。この発見を可能にするためには、豊富な遺伝子から視点を移し、バックグラウンドノイズを下げることで感度を高める必要があります。この目的のために DepleteXテクノロジーを開発いたしました。
DepleteXテクノロジーは、CRISPR-Cas9 の特異性を利用して、次世代シーケンシング (NGS) ライブラリ内の多量で不要なシーケンスを分解します。DepleteX を使用することにより、より低発現の転写産物を検出でき、シーケンシング能力を拡張して、より深いカバレッジとシグナルの改善が実現できます。このことで、必要なものを正確に発見することができ、新境地を切り開くことができます。

DepleteX の仕組み
DepleteX による除去ステップは、アプリケーションに応じて、NGSライブラリ調製プロトコルの様々なステップに直接組み込むことができます。 CRISPR-Cas9 複合体は、さまざまな設計されたガイド RNA で形成されます。切断された標的配列は、その後の PCR 増幅またはシーケンスの対象にはなりません。最終生成物は、直接シーケンス可能な NGS ライブラリになります。

製品の特長
• DepleteX除去の特異性を通常の RNA ライブラリ調製キットと組み合わせ利用。
• 偏りのない効果的な DepleteX 技術による不要配列を除去。
• 低発現のトランスクリプトの検出改善・向上。
• 均一なトランスクリプト検出による高品質データ。
• 目的に応じた多種類のキットを提供しており、今度更に増加致します。
後半に現在（2023年6月）の製品リストを掲載しておりますのでご参照下さい。
* 製品名がCRISPRcleanからDepleteXに変更になりました。

発現量の低いトランスクリプトのリード数が約5倍増加

広範な除去により RNA-Seq が改良され、通常の結果と比較して約2 倍量の遺伝子が検出。例えば、希少疾患の研究に強力な技術になります。

発現プロファイルの高深度解析

PBMC サンプルを用いたCRISPRclean除去及び非除去における細胞クラスターの UMAPプロット比較。CRISPRclean除去による、細胞種判定の影響ありません。除去処理した PBMC サンプルでは、新たに 2 種の細胞種が同定されました。

除去により、あらたな細胞種の発見

DepleteX除去技術による大幅なS/N比の改善により、従来法では確認が出来なかった希少な細胞種を特定することが可能になります。

CRISPRcleanの除去処理により、スポット解像度を高くなり、より多くの遺伝子検出が可能

左図は、X軸のリード数に対するY軸のシーケンス飽和のプロットになります。卵巣腫瘍サンプルを対象に、除去処理 (青) は、非除去 (紫) と比較してリード深度が増加する毎にシーケンシングの飽和度が高くなることが分かります。矢印は、非除去条件で推奨される 50,000 リード/スポットに対して、除去した場合は半分の25,000 リード/スポットのシーケンスで同様の情報が得られることを示しています。

一方、右図は、UMI当たりの遺伝子数（X軸）に対するカーネル密度推定値 (Y 軸) プロットで、スポット当たり 1,000リードで、除去処理 (オレンジ) では、非除去 (青) と比較して 46% 多い遺伝子が検出されています。

rRNA アライメントの界別内訳

DepleteX Plus は、より多くの細菌由来 rRNA を除去し、複雑な微生物サンプルの分類学的構成へのより深い洞察をもたらします。サンプル量 5 ng および 50 ng において、DepleteX Plus および I社のキットによる rRNA を除去した後の分類学的構成による rRNA アライメント率の積み上げ棒グラフでの比較。

COVID19サンプルを用いたrRNA除去の効果